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Applications Biologie Translationnelle

Clonage positionnel

Le clonage positionnel a été développé sur la plateforme EPITRANS dans le cadre d’une approche de génétique classique sur des collections de mutants induites à l’EMS ou des collections d’accessions naturelles chez les plantes cultivées. Cette approche permets de valoriser le matériel biologique crée par l’INRA en clonant et en caractérisant des gènes d’importances agronomiques susceptibles d’être utilisés en sélection.

En effet, plusieurs collections de mutants ont été phénotypées afin qu’elles puissent être valorisables en génétique classique et en génétique inverse. Pour organiser ces données et les rendre accessibles à la communauté scientifique, la plateforme a créé la base de données UTILLdb (Dalmais et al., 2008) qui recense tous les phénotypes, hiérarchisés par traits, des collections affichées dans la base (pois, tomate, Brachypodium et Lin) Cette ressource est ouverte à tous et les graines de lignées d’intérêts peuvent être demandées via les personnes à contacter.

La technologie utilisée sur la plateforme pour cloner des gènes d’intérêts agronomiques est l’analyse en pools de ségrégeants (BSA) par séquençage NGS (MiSeq, Illumina, CLC sequence viewer).

 

Figure: principe du clonage positionnel par une approche de séquençage haut-débit de pools de ségrégants.

 

En fonction des objectifs, du matériel et des moyens de nos partenaires, la plateforme propose son expertise à différents niveaux, pouvant être combinés :

  1. Criblage d’une collection de mutants induite chimiquement pour un trait phénotypique donné.
  2. Séquençage des pools de ségrégants suivi de l’analyse bio-informatique pour identifier le ou les régions causales.
  3. Cartographie génétique fine et validation fonctionnelle du ou des gènes candidats identifiés.

Actuellement, une vingtaine de gènes d’intérêts agronomiques ont été clonés sur la plateforme dont des gènes de résistance aux pucerons (Vat), aux virus (nsv, pvr2, ZYM, etc.), aux champignons (Fo2, PmW, etc.), aux bactéries (Bs), 4 gènes du déterminisme du sexe chez les Cucurbitacées (M, G, A and A2), 1 gène de la restauration de la fertilité mâle (Rfo) et des gènes de floraison et de développement (Ti, Rms2, HR, J-2, etc.)

Sept brevets ont été déposés et plus de 40 articles ont été publiés.

 

Articles majeurs :

  • The pea branching RMS2 gene encodes the PsAFB4/5 auxin receptor and is involved in an auxin-strigolactone regulation loop. Ligerot Y, de Saint Germain A, Waldie T, Troadec C, Citerne S, Kadakia N, Pillot JP, Prigge M, Aubert G, Bendahmane A, Leyser O, Estelle M, Debellé F, Rameau C. PLoS Genet. Dec 8;13(12):e1007089. doi: 10.1371/journal.pgen.1007089. eCollection 2017 Dec.
  • A cucurbit androecy gene reveals how unisexual flowers develop and dioecy emerges. Boualem A, Troadec C, Camps C, Lemhemdi A, Morin H, Sari MA, Fraenkel-Zagouri R, Kovalski I, Dogimont C, Perl-Treves R, Bendahmane A. (2015).  Science. 350(6261):688-91. doi : 10.1126/science.aac8370.
  • A transposon-induced epigenetic changes leads to sex determination in melon. Martin A, Troadec C, Boualem A, Rajab M, Fernandez R, Morin H, Pitrat M, Dogimont C and Bendahmane A (2009) . NATURE 461:1135-1139
  • A Conserved Mutation in an Ethylene Biosynthesis Enzyme Leads to Andromonoecy in Melons.Boualem A, Fergany M, Fernandez R, Troadec C, Martin A, Morin, Sari M, Collin F, Flowers M, Pitrat M, Purugganan M, Dogimont C, Bendahmane A (2008)  Science 321:336-338.

Mutagenèse

TILLING-NGS

Le TILLING (Targeting Induced Local Lesions in Genomes) est une approche de génétique inverse, développée sur la plateforme EPITRANS comme outil de validation fonctionnelle chez des espèces cultivées pour la plupart récalcitrantes à la transformation génétique. Cette technologie permet à nos partenaires de valider la fonction d’un gène directement sur l’espèce cultivée travaillée et d’identifier de nouveaux allèles d’intérêts agronomiques, non OGM.

La plateforme EPITRANS produit et exploite des collections de mutants induites à l’EMS qui constituent aujourd’hui une ressource de plus de 150.000 familles sur une dizaine d’espèces cultivées (melon, concombre, pastèque, courgette, pois, sauge, papaye, lin, poivron et tomate) et une espèce modèle (Brachypodium) et développe également des systèmes de détections de mutations avec les technologies les plus innovantes (séquençage haut-débit, PCR digitale, etc).

Le système de détection de mutations utilisé en TILLING est basé sur le séquençage NGS de librairies de fragments PCR, étiquetés par des séquences uniques et amplifiés à partir d’échantillons poolés en plusieurs dimensions. Les lignées mutantes sont ensuite identifiées en utilisant le logiciel SENTINEL développé par la plateforme et protégé par l’INRA.

 

Figure: principe du TILLING par NGS à partir des collections de mutants disponibles sur la plateforme.

 

Le savoir-faire et les ressources TILLING multi-espèces proposés par la plate-forme EPITRANS sont uniques aux niveaux européen et international.

Pour cette application, la plateforme offre 3 niveaux de savoir-faire:

  1. La détection de mutation dans des régions génomiques ciblées déterminées par le partenaire. Le choix de la collection de mutants à cribler est discuté préalablement avec le partenaire en fonction de ses besoins.
  2. Le 2ème niveau est le même que le précèdent à la différence que le partenaire fourni les ADNs de la collection de mutants à cribler.
  3. Le 3ème niveau consiste à générer des mutants pour un caractère agronomique donné. La plateforme réalise alors la recherche de gènes candidats, la détection de mutations et la validation fonctionnelle. Ce type de contrat est réservé aux compagnies privées.

A ce jour, plus d’une quarantaine d’articles (faire un lien vers la page <Publications>) a été publié grâce à cette approche et 4 brevets ont été déposés.

 

Articles Ressources:

  • A cucurbit androecy gene reveals how unisexual flowers develop and dioecy emerges. Boualem A, Troadec C, Camps C, Lemhemdi A, Morin H, Sari MA, Fraenkel-Zagouri R, Kovalski I, Dogimont C, Perl-Treves R, Bendahmane A. Science. 2015 Nov 6;350(6261):688-91. 
  • First TILLING platform in Cucurbita pepo: a new mutant resource for gene function and crop improvement. Vicente-Dólera N, Troadec C, Moya M, del Río-Celestino M, Pomares-Viciana T, Bendahmane A, Picó B, Román B, Gómez P. PLoS One. 2014. 9(11):e112743
  • Development of a Cucumis sativus TILLinG platform for forward and reverse genetics. Boualem A, Fleurier S, Troadec C, Audigier P, Kumar AP, Chatterjee M, Alsadon AA, Sadder MT, Wahb-Allah MA, Al-Doss AA, Bendahmane A.  PLoS One. 2014. 9(5):e97963
  • PT-Flax (phenotyping and TILLinG of flax): development of a flax (Linum usitatissimum L.) mutant population and TILLinG platform for forward and reverse genetics. Chantreau M, Grec S, Gutierrez L, Dalmais M, Pineau C, Demailly H, Paysant-Leroux C, Tavernier R, Trouvé JP, Chatterjee M, Guillot X, Brunaud V, Chabbert B, van Wuytswinkel O, Bendahmane A, Thomasset B, Hawkins S.  BMC Plant Biol. 2013 Oct 15;13:159.
  • A TILLING platform for functional genomics in Brachypodium distachyon. Dalmais M, Darracq O, Ho-Yu-Kuang S, Wang Y, Bouvier d’Yvoire M, Antelme S, Cézard L, Legée F, Blondet E, Oria N, Troadec C, Brunaud V, Jouanin L, Höfte H, Bendahmane A, Lapierre C and Sibout R.  PLoS One. 2013 Jun 19;8(6):e65503
  •  Engineering melon plants with improved fruit shelf life using the TILLING approach. Dahmani-Mardas F, Troadec C, Boualem A, Lévêque S, Alsadon AA, Aldoss AA, Dogimont C, Bendahmane A. PLoS One 2010 Dec 30;5(12)
  • An induced mutation in tomato eIF4E leads to immunity to two potyviruses. Piron F, Nicolaï M, Minoïa S, Piednoir E, Moretti A, Salgues A, Zamir D, Caranta C, Bendahmane A. PLoS One. 2010 Jun 25;5(6):e11313.
  •  A new mutant genetic resource for tomato crop improvement by TILLING technology. Minoia S, Petrozza A, D'Onofrio O, Piron F, Mosca G, Sozio G, Cellini F, Bendahmane A, Carriero F.  BMC Res Notes. 2010 Mar 12;3:69.
  •  A transposon-induced epigenetic change leads to sex determination in melon. Martin A, Troadec C, Boualem A, Rajab M, Fernandez R, Morin H, Pitrat M, Dogimont C, Bendahmane A. Nature. 2009 Oct 22;461(7267):1135-8.
  • UTILLdb, a Pisum sativum in silico forward and reverse genetics tool. Dalmais M, Schmidt J, Le Signor C, Moussy F, Burstin J, Savois V, Aubert G, Brunaud V, de Oliveira Y, Guichard C, Thompson R, Bendahmane A. Genome Biol. 2008;9(2):R43.
  • A conserved mutation in an ethylene biosynthesis enzyme leads to andromonoecy in melons. Boualem A, Fergany M, Fernandez R, Troadec C, Martin A, Morin H, Sari MA, Collin F, Flowers JM, Pitrat M, Purugganan MD, Dogimont C, Bendahmane A. Science. 2008 Aug 8;321(5890):836-8.
  • Mutation detection using ENDO1: application to disease diagnostics in humans and TILLING and Eco-TILLING in plants. Triques K, Piednoir E, Dalmais M, Schmidt J, Le Signor C, Sharkey M, Caboche M, Sturbois B, Bendahmane A. BMC Mol Biol. 2008 Apr 23;9:42
  • Characterization of Arabidopsis thaliana mismatch specific endonucleases: application to mutation discovery by TILLING in pea. Triques K, Sturbois B, Gallais S, Dalmais M, Chauvin S, Clepet C, Aubourg S, Rameau C, Caboche M, Bendahmane A. Plant J. 2007 Sep;51(6):1116-25

 

Brevets:

  • Method for producing highly sensitive endonucleases, novel preparations of endonucleases and uses thereof. Bendahmane A, Triques K., Sturbois B., Aubourg S., Caboche M., (2004)  PCT/EP2005/009220
  • Genetic system for controlling the floral development of a dicotyledonous plant, and use thereof in detection and selection processes. Bendahmane A, Fergany M, Boualem A, Dogimont C(2007)  PCT/FR2007/051197
  • Combination of 2 genetic elements for controlling the floral development of a dicotyledonous plant, and use in detection and selection processes. Bendahmane A, Martin A, Troadec C, Dogimont C (2008) .PCT/FR2009/051510

MUTAGENESE SATURANTE

La mutagenèse aléatoire induite par des agents chimiques comme l’EMS est une approche simple et efficace pour saturer un génome entier en mutations et par conséquent, se rapprocher d’une approche de mutagenèse ciblée, encore inexistante chez les plantes cultivées récalcitrantes à la transformation génétique. La dose d’agent mutagène ne pouvant être augmentée sans affecter la santé et la reproduction de la plante, l’objectif est de produire des collections suffisamment grandes pour atteindre une probabilité supérieure à 90% de trouver une mutation à chaque G ou C du génome (transition nucléotidique générée par l’EMS).

Un projet pilote a été initié pour produire une collection de mutants saturantes chez la tomate (projet SAMUTAGENE) et pour développer un système de détection de mutants à très haut débit et très sensible, basé sur la technologie de PCR digitale en gouttelettes. Pour ce projet, partant de l’expertise de la plateforme EPITRANS en TILLING, l’objectif est de produire 50 000 familles mutées pour détecter probablement plus de 94% des G et C mutés dans le génome.

Lorsque le système de détection sera validé, il pourra être élargi à d’autres espèces cultivées en fonction des besoins de la communauté scientifique.

Ce projet est financé par un consortium de 5 sociétés privées françaises et étrangères et par l’INRA.

 

Figure: principe de la mutagenèse saturante (extrait du projet SAMUTAGENE, consortium de 5 sociétés privés et de l’INRA pour le développement de la mutagenèse saturante chez la tomate)

FAST-NEUTRON              

Pour accroitre la diversité allélique des collections de mutants sur la plateforme EPITRANS, un projet est en cours de développement pour exploiter des collections irradiées par Fast-Neutron en TILLING.

Ce type de mutagenèse est largement utilisé pour induire des mutants « perte de fonctions ». Cependant, l’utilisation de ces collections en génétique inverse est restée limité, en absence de méthodes de détection suffisamment efficaces pour identifier à la fois de grandes délétions et de petits INDELS et SNPs.

En parallèle du système haut-débit de détection de SNPs par NGS, la plate-forme développe actuellement un deuxième outil de détection spécifique des grandes délétions et des petits INDELS en s’appuyant sur 2 technologies : le NGS et la PCR digitale en gouttelettes.

 

Figure: résumé du projet de développement Fast-Neutron sur la plateforme EPITRANS.

 

Lorsque le système de détection sera validé, il pourra être élargi à d’autres espèces cultivées en fonction des besoins de la communauté scientifique.

Le projet est financé par l’INRA et un partenaire privé.

N’hésitez pas à nous contacter si vous êtes intéressés par cette approche.

Edition du génome

CRISPR

L’apparition de la technologie CRISPR/ Cas9 ouvre de nouvelles opportunités en recherche translationnelle pour découvrir et créer de nouveaux allèles de manière plus ciblée, en complément des ressources obtenues par mutagenèse aléatoire, utilisées en TILLING.

Plusieurs projets de développements ont été initiés sur la plateforme avec 2 objectifs. Le premier consiste à développer une méthode basée sur la technologie CRISPR/ Cas9 pour modifier simultanément des gènes appartenant à la même famille pour faciliter leur analyse fonctionnelle et contourner la redondance qui en découle.

Le second consiste à développer un nouveau type d’agent mutagène de précision avec l’aide du CRISPR/ Cas9 pour produire des collections à haute densité de mutants (cf. Jacob et al., 2018)

Articles

  • Translational Research: Exploring and Creating Genetic Diversity. Jacob P, Avni A, Bendahmane A.Trends Plant Sci. 2018 Jan;23(1):42-52.

  • Natural and induced loss of function mutations in SlMBP21 MADS-box gene led to jointless-2 phenotype in tomato. Roldan MVG, Périlleux C, Morin H, Huerga-Fernandez S, Latrasse D, Benhamed M, Bendahmane A.  Sci Rep. 2017 Jun 30;7(1):4402.

ETHIQUE

 

Pour information, veuillez trouver la Note de la Direction Générale sur les principes et le cadre d’utilisation des technologies d’édition des génomes chez les végétaux à l’INRA. Octobre 2018.

 « Stratégie de l’INRA en matière d’utilisation des technologies d’édition du génome végétale. »

Bioinformatique

UTILLdb

UTILLdb est la 1ère base de données TILLING crée sur la plateforme en 2008 pour organiser et intégrer toutes les données relatives aux ressources phénotypiques et génomiques générées sur la plateforme (Dalmais et al., 2008). Deux types de données sont accessibles : les phénotypes morphologiques des mutants, organisés suivant une ontologie propre à chaque espèce et ouvert au public via l’interface web.

Les recherches sont faites par espèce soit par traits morphologiques désirés soit en naviguant dans la classification phénotypique. Les données de séquences des gènes tillés et les différents allèles détectés sont également recensés dans cette base. La mise à disposition de ces données au public se fait sous réserve de la publication des résultats et/ou de la clause de confidentialité signée entre le partenaire et l’INRA. La base de données recense 4 espèces (pois, tomate, Brachypodium et le lin)

Lors du passage au TILLING par séquençage NGS, cette base de données a cessé d’être implémentée en nouvelles données génomiques, au bénéfice de SENTINEL.

 

Article référence

  • UTILLdb, a Pisum sativum in silico forward and reverse genetics tool. Dalmais M, Schmidt J, Le Signor C, Moussy F, Burstin J, Savois V, Aubert G, Brunaud V, de Oliveira Y, Guichard C, Thompson R, Bendahmane A. . Genome Biol. 2008;9(2):R43

SENTINEL

SENTINEL est un logiciel simple d’utilisation permettant aux utilisateurs de la plateforme aussi bien d’analyser des données de séquençages NGS que d’archiver les résultats. Il combine un pipeline d’analyse bioinformatique avec des bases de données d’archivages.

 

SENTINEL permet l’’identification rapide de mutation rare dans des populations de mutants de grande taille. Le système d’analyse bioinformatique permet d’obtenir la nature, le type et la position de la mutation et d’identifier directement l’individu muté, à partir de données de séquençage.

 

D’un autre côté, les bases de données qui lui sont associées comprennent différentes informations liées aux criblages tels que la structure des populations TILLING disponibles au laboratoire, les données génomiques relatives aux gènes étudiés ou encore l’archivage et la traçabilité des résultats.

 

SENTINEL a été validé sur 38 collections TILLING représentant 11 espèces d’intérêt agronomiques et plus de 1799 amplicons ont déjà été criblés. Il fait régulièrement l’objet de mise à jour avec de nouvelles fonctionnalités comme le stockage ou l’affichage des données produites (liste de mutants).

 

Ce logiciel a fait l'objet d’une Déclaration d'invention pour les œuvres informatiques certifiée par l’agence pour la Protection des programmes.

  • SENTINEL, SOFTWARE dedicated to TILLING by NGS Analysis. Bendahmane, A., Marcel F., Dalmais M., Beaumont G., Mania B.  Certifier par l’Agence pour la Protection des programmes. Inter Deposit Digital Number.FR001.240004.000.R.P.2016.000.10000

PHENORIA

PHENORIA est une application Android pour la collecte de données via un téléphone portable ou une tablette. Elle a été développée sur la plateforme pour faciliter la collecte et l’organisation des données de phénotypage sur les collections de mutants, quel que soit l’endroit de production. Chaque utilisateur peut créer son expérimentation, la décrire (lieu, date de semis, espèce, etc.) et y adjoindre l’ontologie des phénotypes à observer. A chaque observation, l’utilisateur l’enregistre dans le dossier de l’expérimentation et peut y associer des photos. Le dossier peut être partagé par différents utilisateurs.

 

Article référence

  • PHENORIA, an Android based app for managing Plant Phenotypic Data. Mania B. Gomez V. Boualem A. Bendahmane, A. Non publiée.