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Signalisation, régulation et interactions métaboliques

Équipe SRMI / Michael Hodges

 

L'amélioration du potentiel des plantes de cultures nécessite l'identification de parties spécifiques du métabolisme qui peuvent être manipulées pour obtenir de meilleurs rendements. Lorsque l'apport en nutriments est tel que le potentiel de rendement existant est atteint, la seule façon d'augmenter la production est d'améliorer l'efficacité avec laquelle les nutriments sont absorbés et utilisés. Le métabolisme peut être manipulé soit pour obtenir une meilleure assimilation du carbone (par unité d'azote) à un coût énergétique moindre, soit pour augmenter la biosynthèse des composés énergétiques (par exemple NAD) et/ou la capacité d'utilisation des nutriments. Il est important de comprendre les processus de base des voies métaboliques et la façon dont ils sont liés à la biomasse végétale et dont ils répondent aux contraintes environnementales pour guider la sélection végétale et orienter le génie génétique.

Actuellement, l’équipe MetaboActions s ‘implique dans trois grands domaines de recherche :

  • Phosphorégulation des protéines du métabolisme primaire principalement centrée sur certaines enzymes du cycle photorespiratoire.
  • Biosynthèse et recyclage du NAD.
  • Acclimatation des plantes de type C3 à un niveau élevé de  CO2

 


Schéma simplifié montrant les liens entre le cycle de Calvin, la glycolyse, le cycle de Krebs, la photorespiration, le cycle GS/GOGAT et le NAD. L'implication de 4 compartiments intracellulaires est à noter. Les 4 enzymes photorespiratoires phosphorylées étudiées et la première enzyme de la voie de biosynthèse du NAD sont montrées.

 

Phosphorégulation d'enzymes photorespiratoires

La photorespiration est initiée lorsque la RuBisCO assimile l'O2 au lieu du CO2 pour produire du 2-phosphoglycolate (2PG) qui est "toxique" et du 3-phosphoglycérate (3PGA) qui est "utile". Le cycle photorespiratoire métabolise le 2PG en 3PGA, mais ce faisant, il rejette du carbone et de l'azote déjà assimilés en produisant du CO2 et de l'ammonium tout en consommant de l'énergie. Considérée comme un processus de gaspillage, la photorespiration a devenu une cible pour améliorer la photosynthèse et augmenter la biomasse. À ce jour, les principaux gènes et enzymes photorespiratoires ont été identifiés et caractérisés, mais peu de choses sont connues sur la façon dont le cycle photorespiratoire et ses interactions avec les voies métaboliques voisines est régulée.

Le développement récent de la phosphoprotéomique a permis l’accès à une multitude de données phosphopeptidiques. Jusqu'à présent, ces données suggèrent que toutes les enzymes photorespiratoires sauf une, peuvent être phosphorylées. Actuellement, nous essayons de comprendre la fonction et le rôle des sites de phosphorylation associés à la phosphoglycolate phosphatase (PGLP1), la glycolate oxydase (GOX1 & GOX2), l’hydroxymethyltransferase (SHMT1) et l’hydroxypyruvate réductase (HPR1) chez Arabidopsis thaliana.

Afin d’atteindre nos objectifs, nous suivons deux stratégies : l'analyse des protéines recombinantes mutées sur leurs sites de phosphorylation et la complémentation fonctionnelle des lignées mutantes avec des gènes synthétiques pour produire des enzymes photorespiratoires « phosphorylation mimique » ou « non-phosphorylable ». Ces travaux font partie du projet REGUL3P qui est financé par l’ANR.

Nous sommes également toujours impliqués dans deux projets mineurs de phosphorégulation impliquant le métabolisme du 3-PGA et la signalisation par les nitrates en étudiant respectivement la phosphorylation  de la Ser82 de la 3PGA mutase (enzyme de la glycolyse) et les phosphorylations des Ser381 et Ser807 du senseur de nitrate, NLP7.

 

Biosynthèse et recyclage du NAD

Nous sommes également intéressés à comprendre les interactions entre le NAD et le métabolisme primaire des plantes. Malgré le rôle important du NAD dans le métabolisme des plantes et la signalisation du stress, on sait peu de choses sur la biosynthèse du NAD, à l'exception de l'identification d'au moins deux voies possibles. Pour tester l'importance du NAD dans le métabolisme des plantes, nous avons identifié et caractérisé plusieurs gènes et protéines clés de la biosynthèse/recyclage du NAD chez Arabidopsis thaliana, dont la L-aspartate oxydase, la quinolinate phosphoribosyltransférase et la nicotinate/nicotinamide mononucléotide adenyl transferase (N(a)MNAT.

Une meilleure compréhension des propriétés biochimiques de la L-aspartate oxydase et de la N(a)MNAT recombinantes a permis de mieux comprendre comment la biosynthèse du NAD pourrait être régulée par ces enzymes. Parallèlement, l'importance de ces gènes sur l'homéostasie du NAD, la défense contre les pathogènes, la résistance aux stress abiotiques, la croissance et le développement sont étudiés chez les mutants d'insertion d'ADN-T et des lignées surexpresseurs . Ainsi une corrélation entre la teneur en NAD des plantes et l'expression et l'activité de la L-aspartate oxydase a été observée.


Rosettes du mutant et du surexpresseur (OE) de la L-apartate oxydase par rapport à la rosette d’Arabidopsis sauvage (WT)

 

La valeur industrielle de ces travaux a été protégée (De Bont & Gakière, demande de brevet européen et américain) et une subvention « prématuration» de l’IDEX de l'Université Paris-Saclay (EnergyCrop) nous a permis de commencer à tester la surexpression de la L-aspartate oxydase d’Arabidopsis dans la tomate, le colza et le riz.

Acclimatation des plantes de type C3 à un niveau élevé de CO2 lié au changement climatique

Les rendements des cultures doivent augmenter de plus de 70 % au cours des 30 prochaines années pour répondre aux besoins de l'homme, et ce, sans nuire à la qualité nutritionnelle. Un tel défi est encore plus ambitieux si l'on tient compte des objectifs visant à limiter les engrais azotés afin de réduire les coûts et les dommages environnementaux.

L'un des principaux objectifs actuels pour augmenter le rendement est d'améliorer l'assimilation photosynthétique du CO2, mais ces objectifs pourraient être limités par l'acclimatation des plantes de type C3 aux futurs niveaux élevés en CO2 (eCO2). Pour une croissance et un développement optimaux des plantes, il est essentiel d'obtenir une amélioration simultanée de l'efficacité d'utilisation du C et de l'azote pour maintenir l'équilibre C/N. L'acclimatation à eCO2 entraîne une diminution de la conductance stomatique, une réduction de l'expression des gènes de l’appareil photosynthétique entraînant une diminution de la quantité de la protéine RuBisCO et une teneur en N plus faible qui affecte la qualité des semences.

Il est maintenant urgent de mieux comprendre comment les plantes de type C3 s'adaptent/acclimatent aux niveaux de CO2 du changement climatique en termes de métabolisme primaire et dans quelle mesure les régulations épigénétiques et transcriptionnelles jouent un rôle.

Dans le cadre d'un nouveau projet de recherche, nous espérons porter notre attention sur l'impact du eCO2 associé avec le changement climatique sur la photosynthèse et le métabolisme de l'azote dans le contexte de l'acclimatation des plantes de type C3 qui limite les effets bénéfiques d'eCO2 sur le rendement et le contenu en azote. Jusqu'à présent, nous avons comparé plusieurs mutants d'Arabidopsis affectés par une altération des mouvements stomatiques sous eCO2. Les données préliminaires suggèrent que la meilleure croissance observée de plusieurs mutants sous eCO2 par rapport aux plantes WT n'est pas nécessairement corrélée à une meilleure activité photosynthétique.

MetaboActions participe également à un projet INRA de démarrage appelé COSTOMAP pour initier une étude du rôle des mouvements stomatiques contrôlés par la MAPK12 dans un contexte d'eCO2. De plus, PMM est partenaire d'un projet (IRUEC, EIG Concert Japon) qui vise à améliorer l'efficacité de l'utilisation des ressources céréalières dans le contexte du changement climatique. Dans ce projet, les cultivars de blé et de riz sont confrontés à des températures élevées et à des niveaux de CO2 élevés dans différentes conditions de fertilisation en azote.

 

Quelques faits saillants de nos recherches antérieures:

  • L’identification d’une réallocation de C lorsque le cycle photorespiratoire est bloqué, ce qui entraîne une réduction de l'activité photosynthétique et la biosynthèse de moins de protéine RuBisCO pour maintenir l'équilibre C/N ; Dellero et al (2015) Plant J & (2016) J Exp Bot. Pour cet étude il faillait développer une méthode de traçage du 13C couplée à l'analyse par RMN qui est actuellement utilisé pour élucider la voie de biosynthèse d'un terpène pour l'industrie de la parfumerie (Projet SPS202020 PISTILL).
  • Preuves démontrant le rôle crucial de l'activation/phosphorylation de SnRK1 par les kinases SnAK dans le développement des plantes ; Guérinier et al (2013), Glab et al (2017) Plant J.
  • Action du métabolisme énergétique du NAD comme régulateur intégral de plusieurs niveaux de défense ; Petriacq et al (2016) Plant Physiol. L'augmentation de la quantité du NAD améliore la biomasse végétale et le rendement en graines (brevet De Bont & Gakière).

Principales approches utilisées :

  • Génétique inverse : Production et sélection de plantes génétiquement modifiées (mutants d'insertion, microARN artificiel, lignées surexpresseurs, lignées complétées par des gènes mutés).
  • Protéines recombinantes et enzymologie : Production et purification de protéines recombinantes (de type sauvage ou modifiées par mutagenèse dirigée) et analyse de leurs propriétés cinétiques. 
  • Phénotypage et physiologie des plantes : Analyses des métabolites (principalement du métabolisme primaire et redox) par GC-MS, LC-MS/MS, HPLC, marquage avec des isotopes stables (13C, 15N) couplés à la RMN, RMN à proton, mesures d’échanges gazeux (CO2 et H2O), d’activités enzymatiques, et analyses d’expressions géniques (qPCR, ARNseq).
  • Protéomique et phosphoprotéomique (en collaboration avec M. Zivy (PAPPSO)).
  • Biologie translationnelle entre des modèles végétaux et des plantes cultivées.

 

 

La plateforme Métabolisme-Métabolome (PMM)

Cette plateforme est dédiée à fournir des services analytiques adaptés. L'un de ses principaux objectifs est d'offrir une expertise dans l'analyse des métabolites des plantes en développant des protocoles isotopiques et métabolomiques pour permettre le phénotypage métabolique des lignées végétales. De cette façon, la PMM aide à caractériser les conséquences des stress abiotiques/biotiques et des mutations spécifiques, et à déterminer l'efficacité de l'utilisation du carbone, de l'azote et de l'eau en utilisant des technologies adéquates. Il s'agit notamment de profilage de métabolites semi-ciblés et ciblés par GC-MS et RMN, d’analyses isotopiques sur la matière organique totale (EA-IRMS), les gaz (GC-IRMS) et les extraits (LC-IRMS), d’analyses des cofacteurs (par LC-MS), des acides aminés (par HPLC) et de métabolomique non ciblée (combinaison LC-MS/MS et GC-MS). PMM a contribué à la recherche sur divers sujets comme: le stress hydrique et métabolismes C/N chez Medicago, mutants du cytochrome c oxydase d’Arabidopsis, les effets du CO2 sur le métabolisme C dans les feuilles du blé, l’accumulation de sucre dans le melon, la distribution naturelle du 13C dans le palmier à huile, de profilage métabolique de lignées de maïs inoculées avec des bactéries N-fixantes, des réponses de défense associées aux MAP kinases et à l'acide salicylique (SA), de la modification de l’allocation du C dans les mutants photorespiratoires et enfin des mécanismes réactionnels d’enzymes.

 

PMM participe actuellement à plusieurs projets nationaux et internationaux.Les projets en cours comprennent :

  • CYTOPHENO (projet ANR, F Budard, IJPB INRA Versailles).
  • AMAIZING & Project Nitrogen Use Efficiency ("Investissement d'avenir", B. Hirel, IJPB INRA Versailles).
  • PISTILL (projet SPS LABEX, A. Boualem, IPS2).
  • Orchidomique (projet EU, MA Sellosse, MNHN Paris).
  • Tolérance au stress hydrique (projet FSOV, JC Deswartes, Arvalis).

En parallèle, PMM développe des protocoles de détection des mycotoxines dans le cadre du projet FUSAKILL (M. Dufresne, IPS2).

 

L'acquisition récente d'un LC-MS/MS permettra à PMM de détecter des molécules difficiles à mesurer par GC-MS et LC-MS. Il ouvrira également la possibilité d'effectuer des analyses de fluxomique après marquage isotopique. La métabolomique non ciblée est en cours de développement, y compris les métabolites secondaires qui intéressent l'industrie du parfum (PISTILL & FRAGRANCE, A. Boualem, IPS2), et celle du caoutchouc (Cirad Montpellier). La plate-forme s'engage également à rendre toutes les données accessibles via un référentiel public (Metabolights) et elle développe de nouveaux outils pour améliorer la présentation des résultats et des procédures analytiques.

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