See this page in english

Voies de signalisation du stress

Équipe STRESS / Jean Colcombet

L’équipe propose des sujets de masters et de thèse

  • Sujet M2: “Régulation post-traductionnelle de MAPKs d’Arabidopsis thaliana

Responsables: Jean Bigeard (jean.bigeard @ u-psud.fr) et Benedicte Sturbois (benedicte.sturbois @ inra.fr)

Fichier PDF

 

Le génome d’Arabidopsis thaliana code pour plus de 1000 protéines kinases et la grande majorité des protéines de plantes sont potentiellement phosphorylables. L’équipe « Voies de signalisation du stress » s’intéresse plus particulièrement à deux modules kinases impliqués dans les réponses aux stress: les MAPKs (Mitogen-Activated Protein Kinases) et les CDPKs (Calcium-Dependent Protein Kinases). Les modules MAPK sont constitués de trois kinases -une MAP3K, une MAP2K et une MAPK- qui s’activent en série par phosphorylation. Chez les plantes les cascades MAPK sont encodées par des familles multi-géniques qui peuvent, en théorie définir de nombreux modules fonctionnels de signalisation. La plupart des études publiées se concentrent sur trois MAPKs : MPK3, MPK4 et MPK6, ainsi que leurs MAP2Ks et MAP3Ks correspondantes. Il a été montré que ces trois MAPKs s’activaient rapidement en réponse à des stress à la fois biotiques et abiotiques et qu’elles régulaient différents mécanismes de défense comme la synthèse d’hormones et de phytoalexines ou la reprogrammation de l’expression génique. De plus ces mêmes kinases sont aussi impliquées dans différents aspects du développement végétal comme la formation des stomates, la citocinèse et l’abscission. En comparaison peu de choses sont connues sur les autres membres de la famille MAPK. Les CDPKs forment une famille de 34 membres capables de traduire des élévations de concentrations calciques dans le noyau ou le cytoplasme en signaux de phosphorylation. Notre groupe travaille plus spécifiquement sur deux CDPKs: CPK5 et CPK6 qui sont deux régulateurs clefs des réponses aux stress (a)biotiques. CPK5 et CPK6 permettent notamment aux plantes de résister à certaines maladies en régulant de manière redondante le burst oxydatif via une NADPH membranaire et en modifiant les réponses transcriptionnelles. Toutefois peu de substrats de CDPKs sont connus et les mécanismes moléculaires soutenant les fonctions de ces protéines demeurent encore mal compris.

L’équipe « Voies de signalisation du stress» a pour but de développer des approches originales afin de mieux comprendre les processus de signalisation des modules MAPK et CDPK dans un contexte de réponse aux stress. Nous avons ainsi produit des lignées gains-de-fonctions originales (projet 1), des études protéomiques et phosphoprotéomiques (projets 2, 3 et 5) ainsi que des descriptions fonctionnelles de modules MAPK atypiques (projet 4).

 

 

Projet 1

Utilisation de lignées constitutivement actives afin d’élucider le rôle des MAPKs (Julien Lang (julien.lang @ ips2.universite-paris-saclay.fr) )

Les approches pertes-de-fonctions classiques par insertion d’ADN-T ont fourni de nombreuses informations sur le rôle des MAPKs au cours de stress. Toutefois dans certains cas les mutants mapk ne montrent pas de phénotype ou au contraire des phénotypes pléiotropiques qui rendent les analyses fonctionnelles difficiles.

Pour surmonter ces problèmes nous avons commencé à développer il y a près de 10 ans maintenant, des lignées exprimant des formes constitutivement actives (CA) de MAPKs. Cette approche est basée sur un crible fonctionnel original, réalisé chez la levure, qui permet d’identifier des formes mutées de MAPK présentant une hyperactivité indépendante des MAP2Ks en amont (Hudik et al. 2014 Meth Mol Bio). La validité de cette stratégie CA a été apportée avec MPK4, et a permis de clarifier son rôle dans les réponses immunitaires (Berriri et al. 2012 Plant Cell, Colcombet et al. 2013 PSB).

Plus récemment nous avons créé des plantes CA-MPK3. Celles-ci sont naines (figure) et présentent une induction des réponses de défense qui les rendent plus résistantes à certains pathogènes (Genot et al. 2017 Plant Physiol, Lang et al. 2017 PSB). Actuellement nous cherchons à transférer l’approche CA à d’autres MAPKs dont les fonctions sont inconnues. Nous développons également des analyses épistatiques afin de déchiffrer le réseau génique impliquant MPK3 en réponse aux stress.

 

Publications

  • Lang J, Genot B, Hirt H, Colcombet J. Constitutive activity of the Arabidopsis MAP Kinase 3 confers resistance to Pseudomonas syringae and drives robust immune responses. Plant Signal Behav. 2017 Aug 3;12(8):e1356533
  • Genot B, Lang J, Berriri S, Garmier M, Gilard F, Pateyron S, Haustraete K, Van Der Straeten D, Hirt H, Colcombet J. Constitutively Active Arabidopsis MAP Kinase 3 Triggers Defense Responses Involving Salicylic Acid and SUMM2 Resistance Protein. Plant Physiol. 2017 Jun;174(2):1238-1249
  • Hudik E, Berriri S, Hirt H, Colcombet J.Identification of constitutively active AtMPK6 mutants using a functional screen in Saccharomyces cerevisiae. Methods Mol Biol. 2014;1171:67-77.
  • Colcombet J, Berriri S, Hirt H. Constitutively active MPK4 helps to clarify its role in plant immunity. Plant Signal Behav. 2013 Feb;8(2):e22991
  • Berriri S, Garcia AV, Frei dit Frey N, Rozhon W, Pateyron S, Leonhardt N, Montillet JL, Leung J, Hirt H, Colcombet J. Constitutively active mitogen-activated protein kinase versions reveal functions of Arabidopsis MPK4 in pathogen defense signaling. Plant Cell. 2012 Oct;24(10):4281-93.

 

Collaboration

  • Heribert Hirt. Desert Agriculture Initiative, King Abdullah University of Science and Technology, Thuwal, Saudi Arabia

 

 

Projet 2 

Identification des réseaux de signalisation MAPK au cours des réponses de défense (Jean Bigeard (jean.bigeard @ u-psud.fr))

Chez Arabidopsis, MPK3, MPK4 and MPK6 sont des relais essentiels pour la mise en œuvre de divers processus tels que la division cellulaire, le développement ou les réponses immunitaires.

Toutefois seule une poignée de substrats de MPK3, MPK4 et MPK6 a pu à ce jour être validée. Pour combler cette lacune nous avons développé une approche de phosphoprotéomique quantitative permettant de comparer les protéines phosphorylées dans différents fonds génétiques : sauvage, mutants mpk3, mpk4 et mpk6, ainsi qu’en réponse ou non à une molécule MAMP (Microbe Associted Molecular Pattern) élicitrice de réponses de défense (figure). Nous avons récemment publié les résultats de ces analyses pour les fractions cytoplasmiques, mettant en évidence les spécificités de phosphorylation des différents génotypes (Rayapuram et al. 2018 MCP). La caractérisation fonctionnelle de certains substrats candidats, identifiés par cette approche phosphoprotéomique, est actuellement en cours.

 

Publications

  • Bigeard J and Hirt H. Nuclear Signaling of Plant MAPKs. Frontiers in Plant Science (2018) 9:469
  • Rayapuram N*, Bigeard J*, Alhoraibi H*, Bonhomme L, Hesse AM, Vinh J, Hirt H, Pflieger D. Quantitative Phosphoproteomic Analysis Reveals Shared and Specific Targets of Arabidopsis Mitogen-Activated Protein Kinases (MAPKs) MPK3, MPK4, and MPK6. Molecular & Cellular Proteomics 2018 Jan;17(1):61-80
  • Bigeard J, Colcombet J, Hirt H. Signaling Mechanisms in Pattern-Triggered Immunity (PTI). Molecular Plant 2015 Jan 9. pii: S1674-2052(15)00087-8
  • Bigeard J, Rayapuram N, Bonhomme L, Hirt H and Pflieger D. Proteomic and phosphoproteomic analyses of chromatin-associated proteins from Arabidopsis thaliana. Proteomics 2014 Oct;14(19):2141-55
  • Bigeard J, Rayapuram N, Pflieger D and Hirt H. Phosphorylation-dependent regulation of plant chromatin and chromatin-associated proteins. Proteomics 2014 Oct;14(19):2127-40
  • Rayapuram N*, Bonhomme L*, Bigeard J, Haddadou K, Przybylski C, Hirt H and Pflieger D. Paired MSA and ETcaD fragmentation spectra improve phosphopeptide identification of PAMP-triggered phosphorylation/dephosphorylation in Arabidopsis thaliana. Journal of Proteome Research 2014, Apr 4;13(4):2137-51
  • Vandenbogaert M, Hourdel V, Jardin-Mathé O, Bigeard J, Bonhomme L, Legros V, Hirt H, Schwikowski B, Pflieger D. Automated phosphopeptide identification using multiple MS/MS fragmentation modes. Journal of Proteome Research 2012, Dec 7;11(12):5695-703

 

Collaborations

  • Delphine Pflieger. Université Grenoble Alpes, CEA, Inserm, BIG-BGE, Grenoble, France. CNRS, BIG-BGE FR3425, Grenoble, France
  • Heribert Hirt. Desert Agriculture Initiative, King Abdullah University of Science and Technology, Thuwal, Saudi Arabia

 

 

Projet 3 

Régulation post-traductionnelle des modules MAPK chez Arabidopsis (Jean Bigeard (jean.bigeard @ u-psud.fr) et Bénédicte Sturbois (benedicte.sturbois @ inra.fr))

Très peu de choses sont connues sur la régulation post-traductionnelle des modules MAPK. Les interactions protéines/protéines et les modifications post-traductionnelles (PTMs) constituent les mécanismes de régulation post-traductionnelle les plus importants. Les PTMs par exemple influencent des propriétés importantes telles que la stabilité, l’activité enzymatique ou encore la localisation subcellulaire des protéines. Si les MAPKs sont activées par la double phosphorylation de leur boucle d’activation, aucune autre PTM de MAPK n’a été caractérisée à ce jour.

L’objectif du projet est d’identifier les PTMs et les interactants de nos protéines d’intérêt par des approches de purification par affinité en tandem (TAP) couplée à de la spectrométrie de masse (figure). L’analyse fonctionnelle de plusieurs PTMs et interactants candidats est actuellement en cours.

 

Publications

  • Bigeard J, Pflieger D, Colcombet J, Gérard L, Mireau H, Hirt H. Protein Complexes Characterization in Arabidopsis thaliana by Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry Analysis. Methods in Molecular Biology 2014;1171:237-50
  • Pflieger D*, Bigeard J* and Hirt H. Isolation and characterization of plant protein complexes by mass spectrometry. Proteomics 2011, 11, 1–10

 

Collaborations

  • Delphine Pflieger. Université Grenoble Alpes, CEA, Inserm, BIG-BGE, Grenoble, France. CNRS, BIG-BGE FR3425, Grenoble, France
  • Heribert Hirt. Desert Agriculture Initiative, King Abdullah University of Science and Technology, Thuwal, Saudi Arabia

 

 

Projet 4 

Identification de nouveaux modules MAPK activés tardivement en réponse aux stress (Jean Colcombet (jean.colcombet @ u-psud.fr))

Bien que les familles MAP3K, MAP2K et MAPK incluent de nombreux membres, peu de modules MAPK complets ont été caractérisés jusqu’à présent. En 2015 nous avons publié la découverte d’un nouveau module MAPK complet constitué de MAP3K17/18-MKK3-MPK1/2/7/14, module activé par l’acide abscissique (ABA) et jouant un rôle dans l’adaptation de la plante à des conditions de sécheresse (Danquah et al. 2015 Plant J, de Zelicourt et al. 2016 TIPS). Nous avons également montré que contrairement à d’autres MAPKs qui sont généralement activées en quelques minutes après exposition au stress, MPK1/2/7/14 sont activées par l’ABA après plusieurs heures. Cette activation dépend de la synthèse de novo de MAP3K17/18 dont les niveaux d’expression demeurent indétectables en absence de stress (Danquah et al. 2015 Plant J, Boudsocq et al.2015 PSB). A notre connaissance il s’agit de la première description d’un tel module MAPK aussi bien chez les végétaux que chez les animaux. L’implication d’un tel processus d’activation serait que le module MAP3K17/18-MKK3-MPK1/2/7/14 ne régule pas les réponses précoces à des conditions de sécheresse mais plutôt les réponses tardives.

De manière intéressante, MPK1 and MPK2 sont aussi activées par d’autres stress tels que la blessure, l’H2O2 et l’acide jasmonique (JA), suggérant que ces deux protéines pourraient contrôler un ensemble de réponses communes à différents stress. Nous basant sur la littérature ainsi que sur des résultats de notre laboratoire, nous avons émis l’hypothèse que le module MKK3-MPK1/2/7/14 pourrait être activé par n’importe laquelle des huit MAP3Ks du sub-MEKK-like clade III qui sont toutes fortement régulées au niveau transcriptionnel (Colcombet et al. 2016 Frontiers in Plant Science). Présentement nous testons cette hypothèse en étudiant le module dans différents contextes (figure).

 

 

Publications

  • Colcombet J, Sözen C, Hirt H. Convergence of Multiple MAP3Ks on MKK3 Identifies a Set of Novel Stress MAPK Modules (2017) Front Plant Sci. 7:1941
  • Boudsocq M, Danquah A, de Zélicourt A, Hirt H, Colcombet J. Plant MAPK cascade: just rapid signaling modules? (2015) Plant Signal behav. 10:e1062197
  • Danquah A+, de Zélicourt A+, Boudsocq M+, Neubauer J, Frei Dit Frey N, Leonhardt N, Pateyron S, Gwinner F, Tamby JP, Ortiz-Masia D, Marcote MJ, Hirt H*, Colcombet J. Identification and characterization of an ABA-activated MAP kinase cascade in Arabidopsis thaliana (2015) Plant J. 82:232

 

Collaborations

  • Axel Mithöfer, Max Planck Institute for Chemical Ecology, Jena, Germany
  • Anne Krapp, Annie Marion Poll, Loic Rajjou, IJPB, Versailles, France
  • Heribert Hirt. Desert Agriculture Initiative, King Abdullah University of Science and Technology, Thuwal, Saudi Arabia

 

 

Projet 5

Déchiffrer les fonctions de CPK5/6 en réponse aux stress via l’identification de leurs substrats (Marie Boudsocq (marie.boudsocq @ u-psud.fr))

CPK5/6 sont deux acteurs clefs des signalisations calciques, que ce soit en réponse à un stress biotique de type flg22 (Boudsocq et al. 2010) ou un stress abiotique de type salin. Afin de découvrir les mécanismes moléculaires sous-jacents, et notamment les substrats de CPK5/6 nous avons entrepris deux approches complémentaires. D’une part nous avons réalisé un crible double-hybride à haut débit en levure (collaboration avec la plateforme InterAtome, IPS2) qui a produit 8 substrats candidats. D’autre part nous avons tiré avantage de formes constitutivement actives de CPK (CA-CPK) qui sont privées de leurs domaines auto-inhibiteur et d’attachement au calcium, afin d’identifier les substrats de CPK5/6 in vivo.

Nous avons ainsi analysé par phosphoprotéomique des lignées transgéniques d’Arabidopsis exprimant CA-CPK5 ou CA-CPK6 sous le contrôle d’un promoteur inductible au dexamethasone (DEX), soit dans leur forme sauvage soit dans une forme mutée et inactive (CPK-dead) (figure). Par cette approche nous avons pu identifier 25 protéines dont les niveaux de phosphorylation augmentaient dans les lignées CA-CPK5 comparativement aux lignées CPK5-dead. La validation de ces différents candidats est en cours. Nous avons notamment confirmé la phosphorylation in vitro par CPK5 pour la plupart des candidats ; et pour deux d’entre eux nous avons pu isoler le site de phosphorylation ciblé par CPK5. L’étape suivante sera la caractérisation fonctionnelle des substrats identifiés.

 

Collaborations

  • Michel Zivy, PAPPSO, INRA, Gif-sur-Yvette, France
  • Tina Romeis, University of Berlin, Germany
  • Heribert Hirt. Desert Agriculture Initiative, King Abdullah University of Science and Technology, Thuwal, Saudi Arabia