Signalisation, régulation et interactions métaboliques

Équipe MetaboActions / Michael Hodges

 L'amélioration du potentiel des plantes de cultures nécessite l'identification de parties spécifiques du métabolisme qui peuvent être manipulées pour obtenir de meilleurs rendements. Lorsque l'apport en nutriments est tel que le potentiel de rendement existant est atteint, la seule façon d'augmenter la production est d'améliorer l'efficacité avec laquelle les nutriments sont absorbés et utilisés. Le métabolisme peut être manipulé soit pour obtenir une meilleure assimilation du carbone (par unité d'azote) à un coût énergétique moindre, soit pour augmenter la biosynthèse des composés énergétiques (par exemple NAD) et/ou la capacité d'utilisation des nutriments. Il est important de comprendre les processus de base des voies métaboliques et la façon dont ils sont liés à la biomasse végétale et dont ils répondent aux contraintes environnementales pour guider la sélection végétale et orienter le génie génétique.

Actuellement, l’équipe MetaboActions s ‘implique dans 6 grands domaines de recherche :

• Régulation d‘enzymes photorespiratoires.
• Rôle de la photorespiration dans les mouvements stomatiques.
• Métabolisme énergétique : Biosynthèse et recyclage du NAD.
• Bactéries bénéfiques pour améliorer la croissance des plantes dans des conditions de changement climatique.
• Acclimatation du métabolisme primaire lié au changement climatique.
• L’impact du dysfonctionnement des organelles sur le développement de la plantule : skotomorphogenèse et communication rétrograde

Régulation d'enzymes photorespiratoires (Mathieu Jossier, Nathalie Glab)

La photorespiration est initiée lorsque la Rubisco assimile l'O₂ au lieu du CO₂ pour produire du 2-phosphoglycolate (2PG) qui est "toxique" et du 3-phosphoglycérate (3PGA) qui est "utile". Le cycle photorespiratoire métabolise le 2PG en 3PGA, mais ce faisant, il rejette du carbone et de l'azote déjà assimilés en produisant du CO₂ et de l'ammonium tout en consommant de l'énergie. Considérée comme un processus de gaspillage, la photorespiration a devenu une cible pour améliorer la photosynthèse et augmenter les rendements végétaux. À ce jour, les principaux gènes et enzymes photorespiratoires ont été identifiés et caractérisés, mais peu de choses sont connues sur la façon dont le cycle photorespiratoire et ses interactions avec les voies métaboliques voisines est régulée.

Le développement récent de la protéomique a permis l’accès à une multitude de données concernant des modifications post-traductionnelles (PTM). Jusqu'à présent, ces données suggèrent que toutes les enzymes photorespiratoires peuvent être phosphorylées et soumises à des régulations redox. Au cours des dernières années, nous essayons de comprendre la fonction et le rôle des sites de phosphorylation associés à la phosphoglycolate phosphatase (PGLP1), la glycolate oxydase (GOX1 & GOX2), l’hydroxymethyltransferase (SHMT1) et l’hydroxypyruvate réductase (HPR1) chez Arabidopsis thaliana. Plus récemment, nous avons entrepris d’explorer la régulation redox de la PGLP1, une enzyme nitrosylée, sensible au H₂0₂ et présentant méthionine oxydée.

Afin d’atteindre nos objectifs, nous suivons deux stratégies : l'analyse in vitro des protéines recombinantes mutées sur leurs sites de modifications post-traductionnelles et la complémentation fonctionnelle des lignées mutantes avec des gènes synthétiques pour produire des enzymes photorespiratoires soit « phosphorylation mimique » ou « non-phosphorylable », soit insensible aux modifications redox. 

Rôle de la photorespiration dans les mouvements stomatiques (Mathieu Jossier)

La photorespiration est une voie métabolique inhérente à la photosynthèse, fortement influencée par le changement climatique et qui, à son tour, peut grandement affecter la photosynthèse. En effet, le coût énergétique de la photorespiration et sa compétition avec l'assimilation photosynthétique du CO₂ ont un impact négatif sur la croissance et le rendement des plantes. Ce phénomène sera intensifié par le changement climatique, en raison de l'augmentation des températures et de la fréquence des périodes de sécheresse. Dans ce contexte, le contrôle de l'ouverture des stomates est crucial et améliorer la réponse des stomates aux changements environnementaux pourrait grandement améliorer la photosynthèse et l'efficacité de l'utilisation de l'eau, soutenant ainsi la productivité des plantes. La photorespiration a récemment été impliquée dans la modification des mouvements et de la conductance stomatiques dépendants du CO₂ et de la lumière, mais le(s) mécanisme(s) sous-jacent(s) est/sont encore inconnu(s). Les objectifs de ce projet sont de déchiffrer le rôle de la photorespiration dans les mouvements stomatiques chez Arabidopsis thaliana et de déterminer si cela implique l'activité photorespiratoire des cellules de garde stomatiques et/ou des cellules du mésophylle foliaire. La ou les voies de signalisation des cellules de garde et les mécanismes métaboliques impliqués dans les mouvements stomatiques influencés par la photorespiration sont également examinés. Ce projet se base sur l'étude de mutants photorespiratoires d'Arabidopsis thaliana principalement à l'aide de mesures d'échanges gazeux, de microscopie et de profilage métaboliques par GC-MS.

Métabolisme énergétique : Biosynthèse et recyclage du NAD  (Bertrand Gakière)

Nous sommes également intéressés dans la compréhension des interactions entre le NAD et le métabolisme primaire des plantes. Malgré le rôle important du NAD dans le métabolisme des plantes et la signalisation du stress, on sait peu de choses sur la biosynthèse du NAD, à l'exception de l'identification d'au moins deux voies possibles. Pour tester l'importance du NAD dans le métabolisme des plantes, nous avons identifié et caractérisé plusieurs gènes et protéines clés de la biosynthèse/recyclage du NAD chez Arabidopsis thaliana, dont la L-aspartate oxydase, la quinolinate phosphoribosyltransférase et la nicotinate/nicotinamide mononucléotide adenyl transferase (N(a)MNAT.

Une meilleure compréhension des propriétés biochimiques de la L-aspartate oxydase et de la N(a)MNAT recombinantes a permis de mieux comprendre comment la biosynthèse du NAD pourrait être régulée par ces enzymes. Parallèlement, l'importance de ces gènes sur l'homéostasie du NAD, la défense contre les pathogènes, la résistance aux stress abiotiques, la croissance et le développement sont étudiés chez les mutants d'insertion d'ADN-T et des lignées surexpresseurs . Ainsi une corrélation entre la teneur en NAD des plantes et l'expression et l'activité de la L-aspartate oxydase a été observée.

La valeur industrielle de ces travaux a été protégée (De Bont & Gakière, demande de brevet européen et américain) et une subvention « prématuration» de l’IDEX de l'Université Paris-Saclay (EnergyCrop) nous a permis de commencer à tester la surexpression de la L-aspartate oxydase d’Arabidopsis dans la tomate, le colza et le riz.

Bactéries bénéfiques pour améliorer la croissance des plantes dans des conditions de changement climatique  (Axel de Zélicourt)

L'émission constante et importante du CO₂ dans l'atmosphère est une composante majeure du changement climatique. De plus, son augmentation modifie profondément la physiologie de la plante, notamment en jouant sur les grandes voies métaboliques telles que la photosynthèse, la photorespiration ou encore l'assimilation et l'utilisation de l'azote. Les bactéries bénéfiques interagissent avec les plantes en améliorant leur croissance et leur tolérance aux stress environnementaux. Enterobacter sp. SA187 est une bactérie bénéfique augmentant la tolérance des plantes aux stress abiotiques (Andrès-Barrao et al., 2017 ; de Zélicourt et al., 2018 ; Shekawat et al., 2021). Récemment, nous avons montré qu’Enterobacter sp. SA187 améliore aussi la croissance d'Arabidopsis thaliana lorsque celle-ci est cultivée sous une atmosphère élevée en CO₂ (eCO₂, 1000 ppm). Dès lors, nous cherchons à déterminer et caractériser quelles sont les voies modulées par Enterobacter sp. SA187 responsables de cet effet bénéfique. A l'aide du modèle végétal Arabidopsis thaliana, et en combinant des mesures physiologiques à des analyses omiques (transcriptomique et métabolomique), nous cherchons à répondre aux questions suivantes :

1. Quelle est l'influence de l'inoculation de SA187 sur le développement et la physiologie de la plante en condition d’eCO₂?
2. Quelles sont les voies de signalisations végétales et bactériennes et les fonctions métaboliques (concentration hormonale, activité photosynthétique, utilisation de l'azote,…) impliquées dans cette interaction bénéfique?

Parallèlement, nous criblons actuellement une collection de bactéries rhizosphériques et endophytiques dans le but d'identifier de nouvelles bactéries bénéfiques responsables d'une meilleure croissance des plantes en condition d’eCO₂ et/ou en réponse à un stress thermique. Les bactéries les plus prometteuses seront caractérisées puis testées directement sur des plantes cultivées (tel que le blé ou le colza) afin de fournir de nouveaux outils pour augmenter le rendement des plantes dans un futur proche.

Acclimatation du métabolisme primaire lié au changement climatique  (Michael Hodges)

La photosynthèse joue un rôle central dans le captage du CO₂ atmosphérique et constitue un facteur clé à prendre en compte pour atténuer l'augmentation des niveaux de CO₂ à l'échelle mondiale. L'augmentation prévue du CO₂ atmosphérique, jusqu'à 750-1300 ppm avant la fin du siècle, devrait s'accompagner d'une hausse des températures. Une augmentation de la teneur en CO₂ devrait stimuler de 40 % la fixation photosynthétique de ce dernier et avoir ainsi un impact favorable sur la production de biomasse. Toutefois, cette stimulation est beaucoup plus faible que prévu (généralement de l'ordre de 0 à 20 %) dans de nombreuses cultures, y compris les céréales. En outre, le CO₂ élevé a un effet négatif sur le statut minéral et la teneur en protéines des plantes. La stimulation plus faible que prévu de l'assimilation du CO₂ et de la croissance des plantes par le CO₂ élevé est due à des phénomènes d’acclimatation de la photosynthèse et de la nutrition minérale qui sont encore mal compris. Les événements et les voies de signalisation associés à ces acclimatations au CO₂ élevé n'ont pas encore été identifiés et on sait peu de choses sur l'effet combiné du CO₂ élevé et de la température élevée sur l'assimilation du CO₂ et le statut nutritionnel. M2taboactions fait partie d'un consortium qui espère obtenir un financement (PEPR FairCarboN) pour décrypter ces phénomènes complexes d'acclimatation des plantes aux conditions du changement climatique dans le but d'améliorer la capture et le stockage du CO2.

Métaboactions est partenaire d'un projet INRAe DIGIT-BIO 2021 appelé PEERSIM coordonné par les équipes IPS2 GNET/OGE et visant à réévaluer la prédiction d'un scénario multi-stress (eCO2 et température élevée) à partir d'études multi-omiques d'Arabidopsis en simple et double stress.

De plus, la plateforme PMM est partenaire d'un projet (IRUEC, EIG Concert Japon) qui vise à améliorer l'efficacité de l'utilisation des ressources céréalières dans le contexte du changement climatique. Dans ce projet, les cultivars de blé et de riz sont confrontés à des températures élevées et à des niveaux de CO₂ élevés dans différentes conditions de fertilisation en azote.

Impact du  dysfonctionnement des organelles sur le développement de la plantule : skotomorphogenèse et communication rétrograde  (Livia Merendino)

Les plantes sont des organismes sessiles et sont obligées de s’adapter aux changements intempestifs de l’environnement qui les entoure. Je suis intéressée par l’étude des mécanismes d’adaptation de la plante à l’environnement et en particulier le rôle joué par les organites bioénergétiques de la cellule (mitochondrie et plastes) dans ces processus.

Nous avons récemment montré qu’en réponse à un déficit respiratoire au niveau de la mitochondrie, le pattern morphogénétique de la plante est modifié comme pour améliorer sa résistance à un stress mécanique. Nous sommes actuellement en train d’investiguer comment cette réponse pourrait être utilisée par la plante pour émerger à partir d’un sol très compact en cas de germination souterraine. La connaissance qui découlera de ces expériences pourra inspirer des nouvelles stratégies afin d’améliorer la  survie des plantes cultivées en cas de germination souterraine.

Quelques faits marquants de nos recherches antérieures:

• Quelques faits saillants de nos recherches antérieures:

  • L’identification d’une réallocation de C lorsque le cycle photorespiratoire est bloqué, ce qui entraîne une réduction de l'activité photosynthétique et la biosynthèse de moins de protéine Rubisco pour maintenir l'équilibre C/N ; Dellero et al (2015) Plant J & (2016) J Exp Bot. Pour cet étude il faillait développer une méthode de traçage du ¹³C couplée à l'analyse par RMN.
  • Mis en évidence du rôle crucial de l'activation/phosphorylation de SnRK1 par les kinases SnAK dans le développement des plantes; Guérinier et al (2013), Glab et al (2017) Plant J.
  • Action du métabolisme énergétique du NAD comme régulateur intégral de plusieurs niveaux de défense ; Petriacq et al (2016) Plant Physiol. L'augmentation de la quantité du NAD améliore la biomasse végétale et le rendement en graines (brevet De Bont & Gakière).
  • La phosphorylation de la sérine 82 est impliquée dans le mécanisme réactionnel de la phosphoglycérate mutase glycolytique chez Arabidopsis (Duminil l (2021) Plant J).

Principales approches utilisées :

• Génétique inverse : Production et sélection de plantes génétiquement modifiées (mutants d'insertion, microARN artificiel, lignées surexpresseurs, lignées complétées par des gènes mutés).
• Protéines recombinantes et enzymologie : Production et purification de protéines recombinantes (de type sauvage ou modifiées par mutagenèse dirigée) et analyse de leurs propriétés cinétiques. 
• Phénotypage et physiologie des plantes : Analyses des métabolites (principalement du métabolisme primaire et redox) par GC-MS, LC-MS/MS, HPLC, marquage avec des isotopes stables (¹³C, ¹⁵N) couplés à la RMN, RMN à proton, mesures d’échanges gazeux (CO₂ et H₂O), d’activités enzymatiques, analyses d’expressions géniques (qPCR, ARNseq), et microscopie
• Biologie translationnelle entre des modèles végétaux et des plantes cultivées.

La plateforme Métabolisme-Métabolome (PMM) (Bertrand Gakière, Françoise Gilard)

Cette plateforme est dédiée à fournir des services analytiques adaptés. L'un de ses principaux objectifs est d'offrir une expertise dans l'analyse des métabolites des plantes en développant des protocoles isotopiques et métabolomiques pour permettre le phénotypage métabolique des lignées végétales. De cette façon, la PMM aide à caractériser les conséquences des stress abiotiques/biotiques et des mutations spécifiques, et à déterminer l'efficacité de l'utilisation du carbone, de l'azote et de l'eau en utilisant des technologies adéquates. Il s'agit notamment de profilage de métabolites semi-ciblés et ciblés par GC-MS et RMN, d’analyses isotopiques sur la matière organique totale (EA-IRMS), les gaz (GC-IRMS) et les extraits (LC-IRMS), d’analyses des cofacteurs (par LC-MS), des acides aminés (par HPLC) et de métabolomique non ciblée (combinaison LC-MS/MS et GC-MS). PMM a contribué à la recherche sur divers sujets comme: le stress hydrique et métabolismes C/N chez Medicago, mutants du cytochrome c oxydase d’Arabidopsis, les effets du CO₂ sur le métabolisme C dans les feuilles du blé, l’accumulation de sucre dans le melon, la distribution naturelle du ¹³C dans le palmier à huile, de profilage métabolique de lignées de maïs inoculées avec des bactéries N-fixantes, des réponses de défense associées aux MAP kinases et à l'acide salicylique (SA), de la modification de l’allocation du C dans les mutants photorespiratoires et enfin des mécanismes réactionnels d’enzymes.

PMM participe actuellement à plusieurs projets nationaux et internationaux.Les projets en cours comprennent :

• CYTOPHENO (projet ANR, F Budard, IJPB INRA Versailles).
• AMAIZING & Project Nitrogen Use Efficiency ("Investissement d'avenir", B. Hirel, IJPB INRA Versailles).
• PISTILL (projet SPS LABEX, A. Boualem, IPS2).
• Orchidomique (projet EU, MA Sellosse, MNHN Paris).
• Tolérance au stress hydrique (projet FSOV, JC Deswartes, Arvalis).

En parallèle, PMM développe des protocoles de détection des mycotoxines dans le cadre du projet FUSAKILL (M. Dufresne, IPS2).

L'acquisition récente d'un LC-MS/MS permettra à PMM de détecter des molécules difficiles à mesurer par GC-MS et LC-MS. Il ouvrira également la possibilité d'effectuer des analyses de fluxomique après marquage isotopique. La métabolomique non ciblée est en cours de développement, y compris les métabolites secondaires qui intéressent l'industrie du parfum (PISTILL & FRAGRANCE, A. Boualem, IPS2), et celle du caoutchouc (Cirad Montpellier). La plate-forme s'engage également à rendre toutes les données accessibles via un référentiel public (Metabolights) et elle développe de nouveaux outils pour améliorer la présentation des résultats et des procédures analytiques.

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